Marys Medicine

This form should be used to write the project propsal of animal The appendix 'description animal procedures' is an appendix to this form. For each type of animal procedure, a separate appendix'description animal procedures' should be enclosed• For more information on the project proposal, see our Or contact us by phone (0900-2800028).
1 General information
Provide the approval number 10300of the 'Netherlands Food andConsumer Product SafetyAuthority'.
Provide the name of the Stichting Katholieke Universiteit Nijmegen Provide the title of the Endothelial toxicity of adrenal precursors, hydrocortisone and fludrocortisone that are increased in patients with congenital adrenal hyperplasia 2 Categories
Please tick each of thefollowing boxes that appliesto your project.
[] Basic Research[X] Translational or applied research[] Regulatory use of routine production[] Research into environmental protection in the interest of human or animal health or welfare dier[] Research aimed at preserving the species subjected to procedures[] Higher education or training [] Forensic enquiries[] Maintenance of colonies of genetically altered animals not used in other animal procedures 3 General description of the project
3.1 Background
Describe the project (motivation, background and context) with respect to the categories selected in 2.
For legally required animal procedures, indicate which statutory or regulatory requirements apply (with respect to the intended use and market authorisation).
For routine production, describe what will be produced and for which uses.
For higher education or training, explain why this project is part of the educational program and describe the learning targets.
Congenital adrenal hyperplasia (CAH), is a disease resulting from mutations in the genes of one of the enzymes involved in  the production of aldosterone,cortisol and androgen from cholesterol in the adrenal cortex. The most affected enzyme is 21-hydroxylase.  This causes  a blockade in the formation ofaldosterone and cortisol, with accumulation of precursors before the enzymatic  block and overproduction of the not affected  androgens. This causes aclinical picture characterized by symptoms of cortisol and mineralocorticoid deficiency resulting in vomiting and salt-wasting, leading to dehydration anddeath and in prenatal virilisation of the external genitalia in girls. Apart from excess of androgens, precursors of cortisol and aldosterone may accumulate,including 17-hydroxyprogesterone (17OHP), progesterone (P), 21-deoxycortisol (21DF) and androstenedione (Δ4). CAH  is treated with hydrocortisoneand, in particular in case there is no residual function of 21-hydroxylase, a mineralocorticoid (fludrocortisones) to substitute for aldosterone deficiency. Goals of the glucocorticoid treatment is not only the substitution of the lack of cortisol but also to suppress the active pituitary adrenal axis withconsequently suppression of precursors and androgens. Fnal goal of this treatment is the improvement of life expectancy and quality of life.
CAH has been associated with an increased prevalence of cardiovascular risk factors, in particular adiposity, insulin resistance and slightly  increase inblood pressure (Mooij,C.F. et al. Clin Endocrin 2010). Since the low prevalence of CAH does not allow us to investigate the association betweenatherosclerosis and CAH directly, our knowledge of the impact of these risk facotrs on atherosclerosis in the general population strongly suggests thatpatients with CAH are at risk for development of atherosclerotic events. Furthermore, in a scarce study on this topic, intima media thickness appeared to beincreased in (adult) patients with CAH, indicating vascular damage as a consequence of CAH and/or its treatment (Sartorato,P. et al. J Clin EndocrinolMetab 2007).  Both excessive treatment with hydrocortisone and mineralocorticoids (fludrocortisones) as well as accumulation of previously mentionedsteroid precursors may mediate these associations. These factors could act indirectly by mediating the development of a phenotype with increasedcardiovascular risk (often referred to as the ‘metabolic syndrome'). Alternatively or in concert, these steroids may also directly initiate or facilitate theatherosclerotic process. Two cell types act as the main directors of this process: the endothelial cells and inflammatory cells. In addition (and to complicatematters), these cells may also be involved in the pathogenesis of the metabolic syndrome. In this research project, we will assess the direct toxic effects ofthe above mentioned steroids on the capacity of the endothelium in rat small mesenteric resistance vessels (using the Mulvany myograph)  to inducevasodilation in response to exposure to acetylcholine. This ex-vivo bio-assay sensitively detects alteration in endothelial function that is associated with thedevelopment of atherosclerosis (Davignon,J. et al Circulation 2004).
3.2 Purpose
Describe the project's main objective and explain why this objective is achievable.
If the project is focussed on one or more research objectives, which research questions should be addressed during this project? If the main objective is not a research objective, which specific need(s) does this project respond to? In this project, we want to answer the following question: what is the effect of adrenal steroidprecursors relevant in the pathogenesis of Congenital AdrenalHyperplasia (17-hydroxyprogesterone (17OHP), progesterone (P), 21-deoxycortisol (21DF) and androstenedione (Δ4) )  and steroids relevant to thetreatment (hydrocortisone and fludrocortisone) on microvascular function, in particular endothelium-dependent vasodilatation? 3.3 Relevance
What is the scientific and/or social relevance of the objectives described above?
Patients with Congenital Adrenal Hyperplasia often develop the metabolic syndrome (hypertension, diabetes, overweight) which exposes them to anincreased risk of cardiovascular disease, atherosclerosis in particular. For physicians and patients, it is currently uncertain to what extend the disease itself(by accumulation of steroid precursors) or its therapy (including hydrocortisone and fludrocortisone) contribute tho these cardiometabolic consequences. Inaddition, it is not known whether these steroid precursors and therapeutics have a direct toxic effect on microvessels that could contribute tothe atherosclerotic process.
This project will increase our knowledge on the direct vascular effects of steroids involved in the pathogenesis and therapy of Congenital AdrenalHyperplasia and could therefore provide some guidance for clinicians to the direction of subsequent clinical research on how to prevent cardiovasculardisease in patients with this disorder.
As justified in the section 'animal procedures', there is no alternative to study the direct actions of steroids on endothelial function than in isolated vessels ofhealthy adult animals.
  3.4 Research Strategy
3.4.1 Provide an overview of the overall design of the project (strategy).
Substudy aHealthy adult rats will be anesthetised with pentobarbital. The animals will be euthanised with an overdose of the hypnotic pentobarbital. Immediately afterhealthy adult rats have been sacrificed, mesenteric resistance arterioles (diameter < 400 micrometer;  3-4/rat) will be isolated and suspended in a Mulvanymyograph to assess the vasodilator response to acetylcholine and nitroprusside in absence and presence of hudrocortison, fludrocortison and steroidprecursors involved in the pathogenesis of CAH. Twenty to sixty rats will be used for this study part (twenty when a single dose for each steroid is tested;depending on the results1-3 doses will be investigated per steroid).
  Substudy bFor those steroids or precursors  that appeared to affect endothelium-dependent vasodilation in substudy 1 (with a maximum of 2 steroids), we will explorethe role of various endothelium-derived relaxing factors in the steroid-induced endothelial toxicity: Nitric Oxide, prostanoids,  and hyperpolarizingfactors. Twenty rats are reserved for this part of the protocol.
3.4.2 Provide a basic outline of the different components of the project and the type(s) of animal procedures that will be performed.
The rats are euthanized under anesthesia with pentobarbital. Subsequently, mesenterial resitance vessels (diameter 150-400 µm will be suspended in a Mulvany myograph and vasodilator response to vasodilators in absence and presence of steroids will be assessed according to standard procedures (substudy a). When this study reveals significant impact of steroids on vasodilator responses of meenteric resistance vessels, in a subsequent study (substudy b) the role of endothelial relaxing factors will be assessed using pharmacological tools.
This project is feasible since the research team has a longlasting experinece with the use of this experimental set-up and our poweranalysis shows that the number of animals needed to draw reliable conclusions is also feasible.
3.4.3 Describe the coherence between the different components and the different steps of the project. If applicable, describe the milestones and selection points Substudy b (additional pharmacological experiments in isolated mesenteric resistance vessels to further explore the mechanism of endothelial vasodilatordysfunction) will only be performed if results of substudy a indicate an effect of the steroid precursors, hydrocortisone and/or fludrocortisone. Thisapproach limits the number of rats needed in this project as much as possible. In addition, substudy b will serve as an internal verification of the observedimpact of the steroid(precursors) on endothelial vasodilator function in substudy a.
3.4.4 List the different types of animal procedures. Use a different appendix 'description animal procedures' for each type of animal procedure.
Type of animal procedure Ex-vivo vasodilation model This appendix should be enclosed with the project proposal for A different appendix 'description animal procedures' should be enclosed for each type of animal procedure.
• For more information, see our website
Or contact us by phone. (0900-2800028).
1 General information
Provide the approval number of the'Netherlands Food andConsumer Product SafetyAuthority'.
Provide the name of the Stichting Katholieke Universiteit Nijmegen List the different types of Serial number Type of animal procedure animal procedures.
Ex-vivo vasodilation model Use the serial numbersprovided in Section 3.4.4of the Project Proposalform.
2 Description of animal procedures
A. Experimental approach and primary outcome parameters

Describe the general design of the animal procedures in relation to the primary outcome parameters. Justify the choice of these parameters.
For  each animal, the experimental procedure starts with euthanasia with an overdose of pentobarbital (i.v.). This will be performed at the The primary outcome parameter is the vasodialtor response to acetylcholine in mesenterial resistance arteries.
This parameter provides a validated measure of the fucntion of the endothelium to modulate vascular tone. The endothelial factors that are released inrepsonse to acetylcholine (NO, prostanoids and hyperpolarizing factors) play also a role in atherogenesis by modulating function of inflammatory cells andplatelets and by regulating cell growth in the vascular wall.
  Describe the proposed animal procedures, including the nature, frequency and duration of the treatment. Provide justifications for the selectedapproach.
After anesthesia with pentobarbital, and the rat has been killed with an overdose of pentobarbital, the abdomen is opened, the omentum is taken out andmesenteric resistance arteries are isolated and dissected under a microscope. On average three (maximally 4) mesenteric resistance vessels aresubsequently suspended in a Mulvany Myograph and vasodilator responses are assessed ex-vivo. These procedures are performed at Describe which statistical methods have been used and which other considerations have been taken into account to minimise the number ofanimals.
For each vessel, the vasodilator response will be quantified in terms of log EC50 and Emax as determined using generally accepted curve fitting software(Graphpad Prism). The impact of steroids on vasodilator responses will be analysed by comparing log EC50 and Emax using paired t-tests.
Based on previous studies at our department we have performed power calculations indicating that for each steroid 6 vessels originating from 6 different animals should be sufficient to detect a minimal difference in log EC50 and Emax of 0.5 and 28%respectively. This analysis indicates that our model is sensitive enough to detect relevant differences in vasodilator responses. Furthermore, based on anestimate number of 3-4 vessels harvested per rat (which is achievable accroding to our experience), this analysis indicates that we can minimize thenumber of animals needed for this study to 20-60 animals in substudy a (depending on the number of steroid doses that we will explore; we will usemaximally 3 doses per investigated steroid) and 20 animals in substudy b.
  B. The animals
Specify the species, origin, estimated numbers, and life stages. Provide justifications for these choices.
Wistar rats will be used.
We want to assess the impact of steroids on endothelial vasodilator function in (small) mammals with normal physiology (no hypertension, diabetes oroverweight) to prevent any bias of any other endothelium-modulating factors and to mimick the vascular condition of children with Congenital AdrenalHyperplasia without any co-morbidity as much as possible. Less complex animals can not be used since results from these animals can not be translated tohumans at all. Vessels from mice are too small to perform this type of experiments.
Maximum number of animals
Life stage
Male Wistar-Hannover rats C. Re-use
Will the animals be re-used? [X] No, continue with question D.
[] Yes > Explain why re-use is considered acceptable for this animal procedure.
Are the previous or proposed animal procedures classified as 'severe'? [] No[] Yes > Provide specific justifications for the re-use of these animals during the procedures.
D. Replacement, reduction, refinement
Describe how the principles of replacement, reduction and refinement were included in the research strategy, e.g. the selection of the animals, thedesign of the procedures and the number of animals.
replacement:mammals (in stead of less complex animals) are needed to allow translation to humans. Unfortunately, we can not use humans at this stage,
since in humans the endothelial effect of steroids can not be studied in isolation from their systemic adverse actions on blood pressure, insulin sensitivity
and body weight.
reduction: This experiment has been devided in two substudies to allow exploration of a wide array of steroid precursors and therapeutics for Congenital
Adrenal Hyperplasia first before zooming in on the mechanism of endothalial dysfunction. In this way, after 20 animals (3 vessels/animal) we will be able to
conclude whether this approach detects any impact of the studied steroids on endothelial function. If none of the steroids appear to affect endothelial
function, substudy b will be skipped.
refinement: By exposing isolated vessels to our interventions (addition of steroids) we can study the vascular impact of these interventions separately from
any systemic action (blood pressure, insulin sensitivity, body weight etcetera) that these steroids might have when administered systemically in-vivo.
Furthermore it reduces the impact of our study on animal welfare as much as possible, since euthanasia (with pentobarbital) is the only procedure that will
be performed in the living animal.
Explain what measures will be taken to minimise 1) animal suffering, pain or fear and 2) adverse effects on the environment.
The only experimental procedure in the living animal will be euthanasia (under anesthesia), which limits the impact on animal welfare to a minimum.
Repetition and Duplication
Explain what measures have been taken to ensure that the proposed procedures have not already been performed. If applicable, explain whyrepetition is required.
Accommodation and care
F. Accommodation and care
Is the housing and care of the animals used in experimental procedures not in accordance with Annex III of the Directive 2010/63/EU? [X] No[] Yes > If this may adversely affect animal welfare, describe how the animals will be housed and provide specific justifications for these choices.
F. Accommodation and care
G. Location where the animals procedures are performed
Will the animal procedures be carried out in an establishment that is not licenced by the NVWA? [X] No > Continue with question H.
[] Yes > Describe this establishment.
Provide justifications for the choice of this establishment. Explain how adequate housing, care and treatment of the animals will be ensured.
Classification of discomfort/humane endpoints
H. Pain and pain relief
Will the animals experience pain during or after the procedures? [X] No > Continue with question I.
[] Yes > Will anaesthesia, analgesiaor other pain relieving methods be used? [] No > Justify why pain relieving methods will not be used.
I. Other aspects compromising the welfare of the animals
Describe which other adverse effects on the animals welfare may be expected? Explain why these effects may emerge.
Indicate which measures will be adopted to prevent occurrence or minimise severity.
J. Humane endpoints
May circumstances arise during the animal procedures which would require the implementation of humane endpoints to prevent further distress? [X] No > Continue with question K.
[] Yes > Describe the criteria that will be used to identify the humane endpoints.
Indicate the likely incidence.
K. Classification of severity of procedures
Provide information on the expected levels of discomfort and indicate to which category the procedures are assigned (non-recovery, mild,moderate, severe ).
Discomfort code 1 (non-recovery), category: mild.
End of experiment
L. Method of killing
Will the animals be killed during or after the procedures? [] No > Continue with Section 3: 'Signatures'.
[X] Yes > Explain why it is necessary to kill the animals during or after the procedures.
The experiment starts with euthanasia by pentobarbital overdose to allow us to dissect mesenteric resistance vessels without any suffering by the animal.
Is the proposed method of killing listed in Annex IV of Directive 2010/63/EU? [] No > Descripe the method of killing that will be used and provide justifications for this choice.
Dit format gebruikt u om uw niet-technische samenvatting te Meer informatie over de niet-technische samenvatting vindt u op de website
• Of neem telefonisch contact op. (0900-2800028).
1 Algemene gegevens
Titel van het project Endotheliale toxiciteit van bijnierprecursors, hydrocortison en fludrocortison die verhoogd zijn in patientenmet congenitale bijnier hyperplasie Looptijd van het project 24-4-2015 - 1-5-2016 Trefwoorden (maximaal Congenitale bijnier hyperplasie 2 Categorie van het project
In welke categorie valthet project.
U kunt meerderemogelijkheden kiezen.
[] Fundamenteel onderzoek[X] Translationeel of toegepast onderzoek[] Wettelijk vereist onderzoek of routinematige productie[] Onderzoek ter bescherming van het milieu in het belang van de gezondheid of het welzijn van mens ofdier[] Onderzoek gericht op het behoud van de diersoort[] Hoger onderwijs of opleiding[] Forensisch onderzoek[] Instandhouding van kolonies van genetisch gemodificeerde dieren, niet gebruikt in andere dierproeven Beschrijf dedoelstellingen van het Patiënten met een Congenitale bijnierhyperplasie hebben door een enzymdefect in de bijnier een gestoorde vorming van de bijnierhormonen cortisol en aldosteron. Deze hormonen spelen een belangrijke rol in de regulatie van water- en zout huishouding en de reactie op stress. Naast ophoping van voorlopers van deze vraagstelling of het hormonen zal door ontbreken van de normale terugkoppeling door cortisol naar de hypofyse veel ACTH worden wetenschappelijk en/of gemaakt waardoor de bijnier sterk door ACTH wordt gestimuleerd en er veel androgenen worden gevormd. De maatschappelijke belang) behandeling van dit ziektebeeld bestaat primair uit toediening van cortisol (in de vorm van hydrocortison) waarbij vaak ook een vervanger van aldosteron dient te worden gegeven (fludrocortison).
Uit klinisch onderzoek blijkt dat patienten met dit ziektebeeld die met hydrocortison/fludrocortison wordenbehandeld een hoger lichaamsgewicht, hogere bloeddruk en vaker suikerziekte hebben in vergelijking metgezonden van de zelfde leeftijd. We denken daarom dat deze patiënten meer risico hebben op hart- envaatziekte. Met dit onderzoek willen we de vasculaire gevolgen van deze hormonale stoornis beter inkaart brengen waardoor we uiteindelijk de therapie zodanig kunnen verbeteren dat de gevolgen voor debloedvaten zo veel mogelijk beperkt blijven.
Het endotheel speelt een belangrijke rol in de initiatie van atherosclerose. Stikstofoxide dat door het endotheelwordt afgegeven heeft daarbij een belangrijke beschermende functie. De mate waarin het endotheel in staat isstikstofoxide te maken kunnen we in het laboratorium meten door het endotheel bloot te stellen aanacetylcholine (een stof die via receptoren op het endotheel de stikstof-oxide productie activeert, waardoorvaatverwijding ontstaat.
De vraag die we in dit onderzoek willen beantwoorden is of de voorlopers van cortisol en aldosteron danwel detherapie die wordt toegepast (hydrocortison, fludrocortison) een direkt verstorend effect hebben op hetendotheel waardoor minder  stikstofoxide wordt vrijgemaakt en daardoor minder vaatverwijding optreedt.
Welke opbrengsten Uiteindelijk hopen we met de kennis die door dit onderzoek wordt verkregen de behandleing van (nu nog worden van dit project relatief jonge) patienten met Congenitale Bijnierhyperplasie zodanig te verbeteren dat ze op latere leeftijd verwacht en hoe dragen minder last krijgen van de invaliderende gevolgen van atherosclerosis zoals hartinfarct, herseninfarct en verstoorde circulatie van de benen.
wetenschappelijke en/ofmaatschappelijke belang? Welke diersoorten en Substudie a: minimaal 20, maximaal 60 Wistar ratten geschatte aantallen Volgens onze poweranalyse zouden 20 ratten (rekening houdend met uitval van 10%) voldoende moeten zijn zullen worden gebruikt? om een relevant effect van 1 dosis van de diverse genoemde steroiden op acetylcholine-geinduceerdevaatverwijding te kunnen detecteren. OMdat we bij onvoldoende resultaat de mogelijkheid willen openhoudennog twee additionele doseringen van ieder steroid te onderzoeken zijn voor substudie a maximaal 60 rattennoodzakelijk.  Substudie b: 20 rattenOmdat de dosering van de (maximaal 2) te bestuderen steroiden uit substudie a bekend is zijn voor ditonderdeel 20 ratten noodzakelijk.
Wat zijn bij dit project de Het onderzoek begint met het doden van de ratten door middel van een overdosis pentobarbital. Bij leven is er verwachte negatieve een ongerief code 1, non-recovery (categorie: mild).
gevolgen voor het welzijnvan de proefdieren? Ongerief code 1 (non-recovery) dierproeven in hetproject ingedeeld naar deverwachte ernst? Wat is de bestemming De dieren worden gedood in de proef en via van de dieren na afloop? 4 Drie V's
Vervanging Geef aan
Bij de mens kan het geisoleerd effect van 1 steroid(precursor) op endotheelfunctie niet onderzocht worden waarom het gebruik van zonder confounding door effect op bloeddruk, lichaamsgewicht of andere hormonen.
dieren nodig is voor de Ratten zijn nodig omdat de vaatjes van ratten lijken op die van de mens. Muizenvaatjes zijn te klein om beschreven doelstelling deze experimenten in uit te voeren.
en waarom proefdiervrijealternatieven nietgebruikt kunnen worden.
Vermindering Leg uit
Door meerdere vaten per rat te gebruiken is het mogelijk om met een beperkt aantal ratten toch een groot aantal steroid(precursors) te screenen op hun effect op het endotheel. 6 vaten per groep is het absoluut verzekerd dat een zo minimum om representatieve resutaten te verkrijgen. Door de onderzoeksvraag op te splitsen in twee gering mogelijk aantal substudies, zal bij ontbreken van een effect van de gekozen steroiden op endotheelfunctie het aantal dieren dat dieren wordt gebruikt.
voor dit experiment wordt opgeofferd tot een minimum van 20 worden beperkt. Indien substudie a in eersteinstatnie een negatief resultaat heeft (dwz we detecteren geen effect van een steroid op endotheelfunctie) danwillen we graag het onderzoek herhalen bij hogere doseringen van de diverse steroiden. Een maximum van intotaal 60 ratten zal voor substudie a worden ingezet. Omdat we door de resultaten van substudie a weten welkedosis van de steroiden we moeten gebruiken, hebben we voor substudie b slechts 20 ratten nodig.
Verfijning Verklaar de
HJet gebruik van minder complexe diersoorten maakt translatie naar de mens onmogelijk. De mesenteriaalvaatjes van muizen zijn te klein voor toepassing in de Mulvany myograaf. Daarom is gekozen diersoort(en). Verklaar voor de rat. Het onderzoek kan helaas niet in de mens worden uitgevoerd omdat dan het direkt effect van waarom de gekozen de steroiden op de vaatwand niet kan worden bestudeerd doordat systemsiche effecten van de steroiden diermodel(len) de meest (bloeddrukstijging, lgucose stijging, toename lichaamsgewicht en beginnende atherosclerose) de resultaten verfijnde zijn, gelet op de van de metingen zal vertekenen.
doelstellingen van het De vaatjes worden verwijderd uit gezonde ratten. Het onderzoek gebeurt in geïsoleerde vaatjes in een orgaanbad. In deze geïsoleerde gezonde vaatjes bestuderen we het effect van steroiden die verhoogdaanwezig zijn bij patienten met congenitale bijnierhyperplasie. Door deze onderzoeksopzet kunnen we heelprecies conclusies trekken over de acute effecten van deze steroiden op het endotheel van deze vaatjes.
De effecten die we op dit endotheel meten hebben een belangrijke rol in het ontstaan van atherosclerose.
Daardoor kunnen we met deze onderzoeksopzet precies nagaan of deze steroiden na korte blootstellingreeds veranderingen in het endotheel veroorzaken die atherosclerose bevorderen. Dit is precies de vraagdie we met dit onderzoek proberen te beantwoorden. Deze vraag zouden we niet zo precies kunnenbeantwoorden wanneer we de ratten in leven zouden blootstellen aan deze steroiden omdat dan ookandere effecten van deze steroiden (zoals toename in lichaamsgewicht, bloedrukstijging en stijging vanglucose) zouden bijdragen aan de effecten op de vaatwand.
Vermeld welke algemene Doden zal geschieden onder minimaal invasieve anaesthesie.
maatregelen genomenworden om de negatieve(schadelijke) gevolgenvoor het welzijn van deproefdieren zo beperktmogelijk te houden.
5 In te vullen door de CCD
Beoordeling achteraf dat dit effect niet heeft. Andere vragen betreffen kleine, soms slechts tekstuele, wijzigingen in de vergunningaanvraag. Datum antwoord: 17-03-2015 en19-03-2015 Strekking van het antwoord: De gevraagde referenties van de wetenschappelijke achtergrond en haalbaarheid van de doelstelling zijn toegevoegd aan de aanvraag. De aanvrager licht toe waarom het klinisch probleem niet is aangetoond, maar wel degelijk bestaat, waarna de DEC akkoord gaat met de categorie translationeel onderzoek. De functionele testen met leukocyten worden achterwege gelaten. De antwoorden hebben geleid tot aanpassing van de aanvraag. Het DEC-advies is van toepassing op de aangepaste aanvraag. 9. Eventuele adviezen door experts (niet lid van de DEC) Deskundigheid expert: Strekking van het verzoek: Datum expert advies: B. Beoordeling (adviesvraag en behandeling)
1. Het project is vergunningplichtig.
2. De aanvraag betreft een nieuwe aanvraag
3. De DEC is competent om hierover te adviseren. Zij acht zich voldoende onafhankelijk en
onpartijdig, en beschikt over voldoende expertise om een advies uit te brengen over dit projectvoorstel. C. Beoordeling (inhoud):
-uit wetenschappelijk oogpunt verantwoord. 2. De in de aanvraag aangekruiste doelcategorie is in overeenstemming met de hoofddoelstelling. 3. De DEC onderschrijft het belang van de doelstelling, namelijk ‘what is the effect of adrenal steroidprecursors relevant in the pathogenesis of Congenital Adrenal Hyperplasia (17-hydroxyprogesterone (17OHP), progesterone (P), 21-deoxycortisol (21DF) and androstenedione (∆4) ) and steroids relevant to the treatment (hydrocortisone and fludrocortisone) on microvascular function, in particular endothelium-dependent vasodilatation?'. Het wordt ingeschat als een substantieel belang. Indien complicaties voor deze patiëntengroep verminderd kunnen worden, levert dat belangrijke gezondheidswinst op. Voorts kunnen de resultaten van dit onderzoek de aanleiding vormen voor verder fundamenteel onderzoek naar endotheelfunctie. De mogelijke bijdrage aan fundamenteler onderzoek naar vaatschade in meerdere ziektebeelden, vertegenwoordigt eveneens een reëel belang. 4. De gekozen strategie en experimentele aanpak kunnen leiden tot het behalen van de doelstelling binnen het kader van het project. Deze onderzoeksgroep heeft veel ervaring met het beschreven onderzoeksmodel. De gekozen aanpak leidt in elk geval tot meer inzicht in het acute effect van steroïden op endotheel-afhankelijke vasodilatatie. 5. Bijzonderheden op het gebied van categorieën van dieren zijn niet van toepassing. 6. Het ongerief als gevolg van de dierproeven is realistisch ingeschat en geclassificeerd. Het ongerief bij de dieren wordt uitsluitend bepaald door het doden middels een overdosis anestheticum. De DEC schat het ongerief voor de dieren daarom in als mild. 7. Er zijn geen methoden die de voorgestelde dierproeven geheel of gedeeltelijk zouden kunnen vervangen. De doelstelling van het project kan niet gerealiseerd worden zonder
proefdieren of door gebruik van minder complexe diersoorten.
8. In het project wordt optimaal tegemoet gekomen aan de vereiste van de vermindering
van dierproeven. De resultalten uit substudie a worden gebruikt in substudie b, waardoor hier minder dieren nodig zijn. De DEC is van oordeel dat het project kan worden uitgevoerd met maximaal 80 mannelijke Wistar ratten. 9. Het project is in overeenstemming met de vereiste van de verfijning van dierproeven. De
dieren worden in het kader van dit ex-vivo onderzoek op een zo humaan mogelijke wijze gedood. De experimenten worden uitgevoerd op het daarna geïsoleerde weefsel. Verdere verfijning is niet mogelijk. Er is geen sprake van belangwekkende milieueffecten. 10. De niet-technische samenvatting is een evenwichtige weergave van het project, zelfstandig leesbaar, beknopt en begrijpelijk geformuleerd. D. Ethische afweging
Op basis van de onder C genoemde overwegingen komt de DEC tot de volgende ethische afweging. Bij de dierproeven wordt adequaat invulling gegeven aan de vereisten op het gebied van de vervanging, vermindering en/of verfijning van dierproeven. Voor alle dieren blijft het ongerief beperkt tot mild, omdat zij zonder voorafgaande handelingen op een zo humaan mogelijke wijze worden gedood. Tegenover de nadelige gevolgen voor de dieren staat dat met dit onderzoek belangrijke wetenschappelijke inzichten kunnen worden verworven betreffende het acute effect van steroïden op vasodilatatie. Het is aannemelijk dat die inzichten kunnen bijdragen aan het verminderen van vaatschade bij CAH-patiënten, en mogelijk bruikbaar zijn bij fundamenteel onderzoek naar endotheelfunctie. De DEC acht het belang van die doelstelling substantieel, de concrete doelstellingen zijn haalbaar en kunnen niet zonder dieren worden behaald. Naar het oordeel van de commissie rechtvaardigt het belang van de doelstelling het op humane wijze doden van de dieren ten behoeve van het verkrijgen van weefsel waarmee dit onderzoek kan worden uitgevoerd. E. Advies
1. Advies aan de CCD De DEC adviseert de vergunning te verlenen. 2. Het uitgebrachte advies is gebaseerd op consensus. De niet technische samenvatting voldoet niet aan de eisen zoals gesteld in de Dierproeven regeling 2014, voor het invullen van de NTS kunt u gebruik maken van de handleiding aanvraag projectvergunning. Deze kunt u vinden op de website van de CCD: In punt 3.6 van de NTS gebruikt u de naam dit doet mogelijk afbreuk aan de anonimiteit van uw aanvraag en u kunt overwegen deze term te verwijderen uit de tekst. Wij ontvangen graag voor vrijdag 10 april 2015 uw antwoord op onze vraag, en ook de aangepaste NTS en einddatum van uw project om uw aanvraag in de eerstvolgende vergadering van de CCD te kunnen bespreken. Met vriendelijke groet,
Secretariaat Centrale Commissie Dierproeven

Centrale Commissie Dierproeven
Postbus 20401 2500 EK Den Haag
T: 0900 2800028

Dit bericht kan informatie bevatten die niet voor u is bestemd. Indien u niet de geadresseerde bent of dit bericht abusievelijk aan u is gezonden, wordt u verzocht dat aan de afzender te melden en het bericht te verwijderen. De Staat aanvaardt geen aansprakelijkheid voor schade, van welke aard ook, die verband houdt met risico's verbonden aan het elektronisch verzenden van berichten. This message may contain information that is not intended for you. If you are not the addressee or if this message was sent to you by mistake, you are requested to inform the sender and delete the message. The State accepts no liability for damage of any kind resulting from the risks inherent in the electronic transmission of messages. Het Radboudumc staat geregistreerd bij de Kamer van Koophandel in het handelsregister onder nummer 41055629. The Radboud university medical center is listed in the Commercial Register of the Chamber of Commerce under file number 41055629.


Pnas201006899 22145.22150

Dissection of SNARE-driven membrane fusion andneuroexocytosis by wedging small hydrophobicmolecules into the SNARE zipperYoosoo Yanga,1, Jae Yoon Shina,1, Jung-Mi Oha, Chang Hwa Junga, Yunha Hwanga, Sehyun Kima, Jun-Seob Kima,Kee-Jung Yoona, Ji-Young Ryub, Jaeil Shinc, Jae Sung Hwangd, Tae-Young Yoonb, Yeon-Kyun Shinc,e,2,and Dae-Hyuk Kweona,2 aSchool of Life Science and Biotechnology and Center for Human Interface Nanotechnology, Sungkyunkwan University, Suwon 440-746, South Korea;

Active International Research into Cardiometabolic and Liver Effects of a Proprietary Calabrian Bergamot Citrus Extract By James Ehrlich, MD and Jay Williams, PhD A team of Italian physicians and food scientists are leading an aggressive international research agenda into the salutary cardiovascular, metabolic, and hepatic properties of a juice extract of the bergamot citrus fruit (Citrus bergamia, Rutaceae), endemic to Calabria, Italy. After developing one of Europe's top medical research facilities at the Interregional Research Center for Food Safety and Health at the University of Catanzaro, the group has recruited academic physicians from Rome, Australia, and the United States to study the properties of a highly concentrated juice extract called(Bergamot Polyphenol Fraction/BPF 38%). Over the past few years, the group has organized international symposia, published book chapters, and has authored numerous publications concentrating its efforts on three key areas affecting at least 30% of western civilization -- high cholesterol, metabolic syndrome, and fatty liver disease. Safe and effective management of dyslipidemia (elevated cholesterol) with a "natural statin" It is well known that statin cholesterol medications have a long list of adverse side effects, including muscle aches, memory loss, and an elevated risk for diabetes. Finding a natural and safe lipid-lowering alternative is a topic of increased interest among clinicians and proactive citizens. Bergamot polyphenolic fraction (BPF) has been shown to lower LDL- cholesterol , raise HDL-cholesterol and favorably improve the dangerous lipoprotein particle characteristics seen in most Americans who consume excessive carbohydrates. Dietary polyphenols (especially bioflavonoids) may prevent atherosclerosis due to their anti-oxidative and anti-inflammatory proprieties. Among the citrus family (Rutaceae), bergamot fruits contain a very high content of flavonoids, including "statin-like" bruteridin and melitidin, two polyphenols which contain the same HMG-CoA reductase enzymatic activity found in all pharmacologic statins.